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實驗介紹
【技術(shù)原理】
熒光素酶報告基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控常被用來研究培養(yǎng)細胞的生物學特性。熒光素酶是理想的報告基因，因為哺乳動物細胞中不含內(nèi)源性熒光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性的熒光素酶。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)中含有在同一細胞中同時表達的兩種熒光素酶。通常，報告基因?qū)嶒炛型鶗艿礁鞣N實驗條件的影響，共轉(zhuǎn)染的“對照”報告基因會作為內(nèi)對照，為試驗提供一基準線。實驗報告基因經(jīng)過內(nèi)參照的處理可以減小細胞活性和轉(zhuǎn)染效率對實驗的影響，因此雙報告系統(tǒng)減少了外部干擾，使得實驗數(shù)據(jù)更可信。實驗中報告基因和對照基因的酶沒有種源同源性，螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶對應不同的反應底物，反應中沒有任何的交叉干擾。
雙熒光素酶檢測實驗原理圖-轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的經(jīng)典技術(shù)
【實驗流程】
【技術(shù)總結(jié)】
雙熒光素酶實驗通常用于以下研究方向:驗證miR同mRNA靶向互作。將待測mRNA的預測靶向序列插入報告基因載體，再共轉(zhuǎn)入該miR mimics，如果熒光素酶活性下降，則提示為其靶序列。驗證miR同lncRNA靶向互作。將候選的lncRNA預測靶向序列插入報告基因載體中F-Luc的3’UTR區(qū)域，檢測熒光素活性。啟動子結(jié)構(gòu)分析。將啟動子區(qū)域序列（通常2k左右）進行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c進行突變，再分別構(gòu)建入luciferase報告載體中替換啟動子序列，檢測其啟動子活性。驗證特定轉(zhuǎn)錄因子同其調(diào)控序列的作用。將該序列（通常為啟動子區(qū)域）插入報告基因載體，同時在實驗細胞中共轉(zhuǎn)過表達該轉(zhuǎn)錄因子，可分析轉(zhuǎn)錄因子過表達是否提高熒光素酶活性。
案例展示
雙熒光素酶檢測實驗案例（Dual-Luciferase Assay實驗案例）
雙熒光素酶檢測轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子區(qū)的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄激活情況，右側(cè)為載體圖譜及結(jié)合位點
送檢與交付標準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動物組織 | 單個樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標記，且標記清晰可識 |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標，樣本盡量新鮮，細胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測）或直接凍存于-80℃ 2. 若細胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標準的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應實驗要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進行實驗，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應有能夠識別此抗體的標記，抗體的量應大于實驗所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進行預實驗，每個基因至少提供兩對引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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