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        RIP檢測實驗步驟由普拉特澤生物為大家總結分享。RIP就是RNA結合蛋白免疫沉淀，是研究體內 RNA 與蛋白結合情況的技術。普拉特澤生物分子檢測平臺為廣大科研人員提供長期穩定的RIP檢測外包服務，本文就給大家分享RIP檢測技術給大家總結的實驗步驟：

        一、RIP檢測原理與實驗原理

        RIP實驗原理：RIP實驗是研究RNA-蛋白之間的相互作用，運用抗體或表位標記物捕獲細胞核內或細胞質中內源性的RNA結合蛋白，通過免疫學方法將RNA-蛋白復合物一起分離出來，通過對目的片段的純化與檢測（結合的RNA序列通過microarCALU-1y（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量測序（RIP-Seq）方法來鑒定），從而分析蛋白質和RNA相互作用的信息。

        RIP檢測實驗準備：

        1、儀器準備：臺式冷凍離心機、渦旋振蕩器、電子天平、PCR儀、移液器、凝膠成像系統、電泳儀、水平電泳槽、潔凈工作臺、-80度冰箱、數顯恒溫水浴鍋

        2、試劑準備：無水乙醇、苯酚：氯仿：異戊醇、RIP試劑盒、1.5 mL EP管、2 × PCR MIX、IGF2BP2抗體

        二、RIP檢測實驗操作步驟

        1、設計引物

        2、細胞裂解

        （1）加入1 mL PBS洗滌細胞，室溫1000 rpm離心5 min收集細胞棄上清；重復一次。

        （2）細胞沉淀中加入0.9 mL polysome lysis buffer，9 μL Protease inhibitor，4.5 μL RNase inhibitor渦旋混勻，冰上放置 10 min。

        3、去除 DNA

        （1）細胞裂解液中加4.5 μL DNase salt stock、10 μL DNase (20 U)，37℃溫育10 min。

        （2）轉移樣品到冰浴環境，快速加入4.5 μL 0.5 M EDTA、1.8 μL 0.5 M EGTA、9 μL DTT，混勻。

        （3）4℃，16,000 g 離心10 min轉移上清至新的無RNase離心管中。

        4、平衡 protein A/G

        （1）每組RIP樣品準備20 μL protein A/G beads，加入0.5 mL polysome lysis buffer，顛倒混勻，磁力架上去上清； 重復洗一次。

        （2）加入20 μL polysome lysis buffer 恢復初始體積。

        5、免疫沉淀

        （1）將細胞裂解樣品按照0.8 mL（IP）、0.1 mL（Input）分成兩份，Input樣品-80℃保存備用。

        （2）IP 樣品加入實驗抗體或者IgG（陰性對照），垂直混勻器 4℃孵育16 h（過夜）。

        （3）IP 樣品加入準備好的20 μL protein A/G beads，垂直混勻器 4℃孵育1小時，磁力架收集磁珠并去上清。

        （4）IP 樣品加入0.5 mL polysome washing buffer 1、 5 μL DTT洗滌三次去上清， 每次4℃孵育5分鐘。

        （5）IP 樣品中加入94.5 μL polysome washing buffer 1、 0.5 μL DNase salt stock、5 μL  DNase (5 U)，37℃溫育10 min后去上清。

        （6）IP 樣品加入0.5 mL polysome washing buffer 2、5 μL DTT洗滌兩次去上清，每次4℃孵育5分鐘。

        （7）IP樣品加入100 μL polysome elution buffer、1 μL DTT及2 μL proteinase K重懸珠子，Input樣品加入1 μL DTT及2 μL proteinase K。

        （8）55℃孵育1 h，洗脫RNA，磁力架收集磁珠轉移上清至新的無RNA酶離心管中。

        6、提取 RNA

        （1）上清加入等洗脫體積(100 μL)苯酚-氯仿-異戊醇混合液到IP和Input樣品，顛倒混勻15秒。

        （2）13000 g，4℃離心10分鐘，收集上層水相，轉移到新無RNA離心管中。

        （3）加入1 μL Glycogen，10 μL sodium acetate及250 μL 100% ethanol充分顛倒混勻。

        （4） –20℃靜置3 h到過夜沉淀RNA樣品。

        （5） 4℃，16000 g 離心30分鐘，棄上清。

        （6）加入1 mL預冷的80%乙醇，4℃，16100 g 離心10分鐘，棄上清，室溫風干10分鐘。

        （7）加入30 μL RNase-free water溶解RNA，-80℃保存。

        7、RNA檢測

        （1）取2 μL RNA樣品檢測RNA濃度。

        7.8 結合RNA效率驗證（PCR)

        （1）參考逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄RNA樣品。

        （2）參考PCR試劑盒配置反應體系進行PCR，取10 μL PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳。

        RIP檢測實驗步驟就講完啦，如果您還有什么實驗技術問題或有RIP檢測外包的需求歡迎隨時聯系普拉特澤生物~

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