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2025-08-29 13:32:16
實驗介紹
【技術原理】
DNA分子中由于發生堿基對的增添、缺失或改變進而引起基因結構的改變，稱為基因突變。定點突變 （mutagenesis）是通過PCR等方法向目的DNA片段中引入突變，包括堿基的添加、刪除、點突變等。該技術能迅速、高效地改變DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是研究蛋白質結構和功能之間復雜關系的有力工具，也是研究人員在實驗室中改造、優化基因常用的一種非常有用的手段。目前，由PCR介導的定點突變相比于其他突變技術具有周期短、成功率高、不受酶切位點限制等優點，是使用最普遍的定點突變方法。
【實驗流程】
案例展示
常見問題
常見問題1：質粒模板無法正常擴增
可能原因及解決方法：
（1）引物設計有誤：核對引物設計方案；
（2）擴增體系配制錯誤：重復實驗；
（3） 擴增反應條件不優化：調整Mg濃度、酶量、擴增程序；
（4）模板質粒質量偏差：長期放置、反復凍融會導致模板質粒斷裂、開環或降解，應使用新鮮制備的質粒作為模板。
常見問題2：平板上長不出克隆或克隆數目很少
可能原因及解決方法：
（1）感受態效率低：使用新制備或妥善凍存的感受態細胞，確保轉化效率>cfuμg。每次可設置一組轉化質粒的對照實驗，以檢測感受態細胞的轉化效率；
（2）重組反應體系中DNA量不足,或者比例不佳(雙堿基突變)：盡量按照推薦DNA的量配制反應體系；
（3） 重組環化反應體系中DNA不純,抑制反應：未純化DpnI消化產物加入重組反應體系內的總體積不應超過μl(反應體系體積)。嘗試對DpnI消化產物進行膠回收純化；
（4）感受態細胞中加入了過多的反應產物：反應產物的轉化體積不應超過感受態細胞體積的，否則會降低轉化效率；
（5）出現轉化抑制效應：當轉化的DNA濃度太高時，會抑制轉化反應。將重組反應產物稀釋倍后取進行轉化。
常見問題3：定點突變未正確完成
可能原因及解決方法：
（1）引物設計錯誤：核對引物設計方案；
（2）擴增反應所用模板為非甲基化的質粒：DpnI只能識別甲基化DNA，請務必使用從甲基化酶無缺陷的宿主菌中擴增的質粒作為PCR模板；
（3）擴增反應使用過多的模板質粒：對于大多數質粒，ng模板量已足以使擴增反應正常進行，過多的質粒模板將會導致DpnI消化不完全，降低突變成功率。
常見問題4：非目標位點突變
可能原因及解決方法：
（1）模板質粒攜帶未知位點突變：測序確認模板質粒序列正確性。
（2）擴增循環數過多：為了防止擴增過程中引入非目標突變，擴增循環數不宜超過30。如果擴增效率良好的話，推薦擴增循環數應不超過35。
送檢與交付標準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動物組織 | 單個樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標記，且標記清晰可識 |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標，樣本盡量新鮮，細胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測）或直接凍存于-80℃ 2. 若細胞處理（加藥、轉染、感染）后狀態差應酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標準的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應實驗要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進行實驗，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應有能夠識別此抗體的標記，抗體的量應大于實驗所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進行預實驗，每個基因至少提供兩對引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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