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實驗介紹
【應用簡介】
在細胞實驗中，對于按常規方法難以轉染甚至無法轉染的細胞，通過使用病毒介導的方式能夠大大提高基因的轉導效率，達到目的基因高效表達的目的。
具體來說，慢病毒包裝主要應用于以下幾個方面：
1、對于難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能大大提高目的基因轉導效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，極大地方便了RNAi，cDNA克隆以及報告基因的研究；
2、進行穩轉細胞株的篩選；
3、為活體動物模型實驗提供高質量的包含目的基因的病毒液。
【技術原理】
慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質?？商峁┧械霓D錄、包裝、重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝。包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中。離心收集上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。
【實驗方法】
1、細胞準備：細胞傳到后，密度達到70％左右時進行轉染；
2、細胞轉染：取兩個EP管，一個加入Opti-MEM、核心質粒和包裝質粒；另一個加入Opti-MEM、lipo2000，然后將兩管混勻；
3、細胞孵育：將混合液逐滴加入細胞培養皿中，混勻后孵育；
4、收集病毒：轉染后48h、72h收集含慢病毒的上清；
5、滴度檢測：細胞為30%－50％時加入病毒上清液，檢測陽性細胞比例。
案例展示
慢病毒感染的細胞（左：白光；右：熒光）
技術總結
1、獲取的目的基因一定要精確（注：客戶提供基因ID）；
2、針對目的基因設計合成shRNA建議設計3對，以保證效果，節省實驗周期；
3、要選擇符合要求的載體；
4、構建的過慢病毒載體需要經過測序驗證；
5、對于測序正確的重組質粒，需要提取和純化高質量的不含內毒素的重組質粒；
6、使用高效重組載體和包裝質粒共轉染293T細胞，進行病毒包裝并收集上清液；
7、通過超濾和超速離心濃縮和純化病毒；
8、建議病毒使用前先測定病毒滴度。
送樣與交付標準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 凍存細胞 | 1.取對數生長期的細胞，消化離心收集細胞，加入凍存液吹打混勻，裝入凍存管，標明細胞名稱/細胞代數，凍存細胞數量在1-5*106個/ml。 2.項目啟動后細胞復蘇，復蘇后3天反饋細胞狀態，3-5天反饋細胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細胞詳細信息（名稱、培養基和其他培養條件等，如經過特別處理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標記，且標記清晰可識 |
| 復蘇后細胞 | 1.使用T25培養瓶運輸。細胞匯合度達到60%以上，裝滿培養液，只留紐扣大小的氣泡，瓶口用封口膜封好，標明細胞名稱/細胞代數/接種時間/培養基類型，瓶子固定運輸。 2.收到細胞后3天反饋細胞狀態，3-5天反饋細胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細胞詳細信息（名稱、培養基和其他培養條件等，如經過特別處理需告知并提供必要的信息） | 常溫 | 常溫 | |
| 質粒 | 1.純度高，無內毒素，無蛋白質，基因組DNA/RNA污染，質粒A260:A280的比值在1.8-2.0之間 2.濃度不低于0.5μg/μl，總量大于100μg，無內毒素處理 3. 載體詳細信息，包括名稱、大小、抗性、熒光標記 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，體積約200μl，標明制備時間，且沒有反復凍融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，體積約200μl，標明制備時間，且沒有反復凍融 3.明確是否表達熒光標簽蛋白及其種類，最好需要提供病毒載體圖譜； | -80℃ | 干冰 |
交付標準：
滴度:>108TU/ml
規格:1ml
贈送陰性對照病毒規格:0.2ml（>108TU/ml）
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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