基因表達調控及相關元件介紹及下載

高中階段我們學過中心法則，中心法則是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質，即完成遺傳信息的傳遞過程。生物體的絕大部分生命活動都遵循該法則。中心法則主要是圍繞DNA，RNA，蛋白質來展開，通過這個過程實現遺傳信息的表達與傳遞。
那三個生物大分子之間是如果進行遺傳信息的傳遞的呢？首先，遺傳信息儲存在DNA中，通過轉錄將遺傳信息轉移到mRNA中，mRNA中含有密碼子，一個密碼子決定一個氨基酸，氨基酸最終組成蛋 白質，這個過程也就是蛋白質的翻譯過程。除了mRNA 以外，RNA還包括rRNA（它與蛋白質結合而形成核糖體，其功能是在mRNA的指導下將氨基酸合成為肽鏈），tRNA（tRNA能根據mRNA的遺傳密碼依次準確地將它攜帶的氨基酸連結起來形成多肽鏈）。

圖一 中心法則

    今天我們以前來回顧一下真核生物基因表達的過程，這個過程涉及許多的名詞，在平時的科研生活中，很多同學對這些名詞也都很困惑，今天咱們就系統性的來復盤一下。

首先我們看一下基因的結構：基因是染色體上具有控制生物性狀的DNA片段。基因在結構上可分為編碼區和非編碼區，且非編碼區多于編碼區。在非編碼區，存在著許多的元件，它們雖不直接參與基因的轉錄和翻譯，但也對基因的表達起這重要的作用。

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圖二 基因結構及作用元件

增強子是存在于DNA上的一段可以與蛋白質結合的區段，增強子通過影響DNA的結構和功能，結合特定的轉錄因子和輔因子，從而激活或增強基因的轉錄，對真核基因的時空表達起著重要的調控作用。

    啟動子的主要作用是啟動和調控基因的轉錄。啟動子可以活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地結合并具有轉錄起始的特性。它能夠指導全酶同模板正確結合，活化RNA聚合酶，啟動基因轉錄。啟動子區一般包含兩個保守結構域，分別是CAAT Box（控制轉錄起始的頻率）和TATA Box（使轉錄精確地起始）。

    終止子是位于基因末端，給RNA聚合酶提供轉錄終止信號的DNA序列。

    沉默子：沉默子是一段能夠結合轉錄調節因子的DNA序列，這種轉錄因子稱為阻遏蛋白。與增強子對DNA轉錄的加強作用相反，沉默子會抑制DNA的轉錄過程。

    非編碼區的這些元件統稱為順式作用元件包括啟動子，增強子，沉默子等，可與轉錄因子結合。

    說完了非編碼區，我們再來看看編碼區。編碼區主要由內含子和外顯子組成，真核生物絕大部分是斷裂基因，內含子和外顯子交替排布。

    外顯子是斷裂基因中的編碼序列，在后續mRNA的加工過程中被保存，是能編碼蛋白質的核苷酸序列。

    內含子是基因中無編碼功能的序列，也存在于pre-RNA中。

那么基因又是怎么成為直接參與生物體生命活動的蛋白質的呢？這就涉及到基因的表達，今天我們主要講一下基因表達的轉錄和翻譯這兩個過程。

    轉錄：是以DNA為模板，以4種NTP為原料，依據堿基配對規律，在DNA 指導（或依賴 DNA）的 RNA聚合酶催化下合成RNA的過程。真核生物的轉錄涉及許多的酶類以及蛋白因子，其中最重要的是轉錄因子和RNA聚合酶。

    轉錄因子（Transcription Factors, TFs）指能夠以序列特異性方式結合DNA并且調節轉錄的蛋白質。包括TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、TFIIJ。

    RNA聚合酶（RNA polymerase）是以一條DNA鏈或RNA為模板，三磷酸核糖核苷為底物，通過磷酸二酯鍵而聚合的合成RNA的酶，包括RNA聚合酶Ⅰ（合成rRNA），RNA聚合酶Ⅱ（合成mRNA），RNA聚合酶Ⅲ（合成tRNA），線粒體RNA聚合酶（合成線粒體RNA）。

    了解完轉錄的基本概念和所需的重要的蛋白質和酶類后我們來看看轉錄的具體過程，轉錄分為3個過程，分別為轉錄起始，轉錄延長，轉錄終止。

    起始：RNA聚合酶對轉錄起始位點上游的DNA序列進行辨認，同時打開DNA雙螺旋結構，依賴轉錄因子結合啟動子形成復合物。

圖三 轉錄起始

延長：合成一段含有60-70個核苷酸的RNA分子后，RNA聚合酶根據堿基互補配對原則，從5’-3’方向逐個加入核糖核苷酸，進入轉錄延長期。

                                                                                         圖四 轉錄延長

終止：真核生物目前并沒有明確的轉錄終止信號，且3種RNA的合成終止方式不同。對于mRNA來說，在結構基因的最后一個外顯子的3’端常有一組共有序列AATAAAA，其下游還有GT序列，這些序列為轉錄終止的修飾點，當RNA聚合酶轉錄出AAUAAA后，多聚腺苷酸特異因子（CPSF）能識別并與它結合，指導前mRNA的切割。在CPSF及切割活化因子（CstF）等因子的指導下，特異的內切核酸酶在AAUAAA下游11-30個核苷酸出切斷RNA鏈， mRNA前體轉錄停止。

圖五 轉錄終止

 剛轉錄出來的mRNA又被稱為核不均一RNA（hnRNA），該RNA分子量非常大，且僅有10%的部分后期能轉變成成熟的RNA，其余部分在轉錄后的加工過程中被降解。其結構為：轉錄起始位點、外顯子、內含子、轉錄終止位點。

    hnRNA又是如何成為成熟的mRNA的呢？這就涉及到mRNA前體物質的加工過程，真核生物mRNA的加工一般包括：mRNA前體剪接，mRNA的修飾（5’加帽和3’多聚腺苷酸化），mRNA編輯。

   5’帽子結構：合成一段RNA后，在鏈5’端加入鳥嘌呤核苷酸且在鳥嘌呤7號位氮上發生甲基化形成一個類似于帽子的結構。帽子結構的生理功能主要是為核糖體識別mRNA提供了信號，帽子結構是核糖體識別mRNA所必須的；帽子結構增加mRNA的穩定性，保護mRNA免受5’外切核酸酶的降解；帽子結構還能有助于成熟的mRNA的轉運，有助于前體RNA的正確拼接。

    3’多聚腺苷酸尾巴：與hnRNA的形成同步發生。先由核酸外切酶切去前體RNA的一些核苷酸，再加入polyA尾。多聚腺苷尾巴結構的生理功能主要是提高RNA的穩定性；增強RNA的翻譯效率。

    mRNA前體剪接：內含子區段彎曲使外顯子靠近，然后在5’-GU/AG-3’處經過兩次轉脂反應被剪去后外顯子進行拼接。外顯子不同的拼接方式會導致不同的轉錄本（轉錄本是由一條基因通過轉錄形成的一種或多種可供編碼蛋白質的成熟的mRNA）的產生，這里就涉及到不同的轉錄本問題（對轉錄本有研究的小可愛評論區留言，討論）。

  mRNA 編輯：對外顯子進行加工，核苷酸的插入、刪除或轉換，從而改變RNA的序列使遺傳信息在mRNA上發生改變。

 
   經過加過后前體RNA成為去掉內含子，加上帽子結構（GpppmG），加上polyA尾巴的成熟的可被翻譯成蛋白質的mRNA。加工過程如下圖。

                                                                                            圖六 前體RNA的加工成熟過程
 其結構包括：5’帽子結構、5’UTR區、CDS區、3’UTR區、polyA尾巴。那各個區段的含義又是如何，接下來我們一個個來解釋。

     5’UTR: 5’UTR區位于帽子結構之后，指從mRNA的一端到編碼序列的起始密碼子之間的一段序列。該區域可能包起始始密碼子序列、RNA穩定性元件和翻譯起始調控序列。5’UTR是翻譯起始的高度敏感區，其長度、二級結構以及AUG的數量都會影響翻譯起始的效率。

    編碼區（CDS）：編碼區包括mRNA的一系列密碼子，它們會被翻譯成蛋白質的氨基酸序列。編碼區由起始密碼子（通常為AUG）和終止密碼子（例如UAA、UAG或UGA）標識。生物學中構建的各種載體時所需的引物都是針對CDS來設計合成的。需要與ORF區分開來（開放閱讀框是從起始密碼子到種子密碼子中間的序列。CDS必定是一個ORF。但也可能包括很多ORF。反之，每個ORF不一定都是CDS）。

    3’UTR: 3’UTR區指從編碼序列的終止密碼子到mRNA鏈的末端之間的一段序列。該區域可能包含穩定性元件、調控序列和終止子序列。

    接下來根據成熟信使RNA的核苷酸順序，以3個核苷酸組成一個遺傳密碼決定一個氨基酸的方式合成多肽，從而將mRNA中的遺傳信息轉換成蛋白質氨基酸序列。翻譯過程同樣涉及許多重要的酶、蛋白因子等。

    核糖體（Ribosome）是翻譯發生的場所，是翻譯過程中mRNA結合tRNA的空穴，有A位（氨酰tRNA進入核糖體后占據的位置）和P位（肽酰tRNA進入核糖體后占據的位置），核糖體包括大小兩個亞基。

    遺傳密碼（condon）是指mRNA分子上沿5'端到3'端方向，由起始密碼子AUG開始，每三個核苷酸組成的三聯體。它決定肽鏈上每一個氨基酸和各氨基酸的合成順序，以及蛋白質合成的起始、延伸和終止，遺傳密碼子分為起始密碼子（AUG）和終止密碼子（UAG、UAA、UGA）。

    tRNA稱為轉運RNA，既能識別mRNA上的遺傳密碼，又能與相應的氨基酸結合。tRNA上含有反密碼子，可與密碼子配對，確保氨基酸的準確性。在翻譯過程中tRNA可以跟氨基酸結合成為氨酰-tRNA（位于核糖體的A位點上），也可以跟肽鏈結合成為肽酰-tRNA（位于核糖體的P位點上）。

   翻譯過程中也需要許多的因子來協助，包括起始因子（參與蛋白質起始復合物的形成），延長因子（與氨酰-tRNA及GTP結合形成復合物，將氨酰-tRNA轉入A位點）和釋放因子（識別終止密碼子，終止肽鏈的合成釋放肽鏈）。

我們來了解下翻譯的基本過程。翻譯的基本過程也分為三個：翻譯起始、翻譯延長、翻譯終止。

    翻譯起始：翻譯過程主要的事件是起始氨酰-tRNA和mRNA分別與核蛋白體結合形成翻譯起始復合物。主要分為以下幾個步驟，首先核糖體大小亞基分離，核糖體40S小亞基與起始tRNA結合甲硫氨酸形成起始復合物前體；同時由于轉錄起始復合物前體與AUG距離較遠，因此需要沿著mRNA鏈進行掃描，直至第一個AUG與tRNA的反密碼子配對，mRNA才準確定位在核糖體小亞基；核糖體大亞基結合；當起始復合物前體識別AUG后，核糖體小亞基在酶的作用下解離，核糖體大亞基結合，形成翻譯起始復合物。

    翻譯延長：主要事件是翻譯起始復合物形成后，核糖體從mRNA的5’端向3端移動，依據密碼子順序，從N端開始向C端合成多肽鏈。通常分為3個過程：進位（核糖體A位點上mRNA密碼子所規定的氨酰-tRNA進入核糖體A位點）；轉肽（氨酰-tRNA進位后，核糖體A位和P位上各結合了一個氨酰-tRNA，在酶的催化下，P位上的起始tRNA所攜帶的甲酰甲硫氨酰基的羧基與A位點的氨基酸的ɑ氨基形成肽鍵）；移位（在延長因子的催化下，GTP水解為移位提供能量，使mRNA與核糖體相對移位一個密碼子的距離，P位上的tRNA從P位釋放，A位上的肽酰-tRNA移到P位，mRNA分子上的第三個密碼子進到A位，為下一個氨酰-tRNA進位做好準備）。

    翻譯終止：當mRNA上出現終止密碼子后，氨酰-tRNA無法結合到A位，但釋放位子可以進入A位，此時核糖體上的肽鏈脫落，mRNA與核糖體分離，核糖體解離成大小亞基。

圖七 真核生物翻譯過程
至此，一個具有特定生物學功能的蛋白質合成完成。

    轉錄和翻譯過程中涉及了非常多的元件，各自的序列也有不同的特點，那我們日常使用的比較多的序列主要是以下幾種，我們先來了解一下這些序列平時的用途。

    啟動子序列：轉錄因子預測；啟動子序列對比及保守性分析。

    CDS序列：不論是PCR還是QPCR，都是根據CDS序列來設計引物進行擴增以便進行后續的實驗。

    UTR區：對于研究一個基因的不同的剪切本有幫助（5’UTR區含有內含子，內含子最突出的作用是可以被選擇性剪接，進而產生不同功能的蛋白質，并且無論內含子處于在基因結構的哪個位置，均可以調控基因的表達并涉及到每一步，包括mRNA的轉錄、翻譯、定位以及衰變等過程）。miRNA和靶基因的相互作用關系（雙熒光素酶實驗）。

    蛋白質序列：我們可以將獲取的氨基酸序列用特定發的蛋白質分析軟件進行分析，以便我們可以了解蛋白質基本性質分析；疏水性分析；跨膜區預測；信號肽預測；亞細胞定位預測；抗原性位點預測（相關網站如下：SCOP蛋白質結構分類數據庫；PDB數據庫；UniProt數據庫；SWISS-PROT 數據庫；Pfam數據庫；STING數據庫。（對這部分內容有感興趣的小伙伴可以留言討論）。

 mRNA序列：mRNA序列可用于動物實驗中siRNA, shRNA的設計與合成。

    了解了轉錄翻譯的具體過程以及每個過程產物最終的結構，在日常的科研活動中經常會遇到需要查找這些結構的序列用于重組載體構建或基因編輯以及基因調控等方面，那又怎么查找這些序列呢？這里我們就要用到一個功能非常強大的生物學數據庫。
NCBI是美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information）的縮寫，它是一個國際上權威的生物信息學數據庫。NCBI提供了包括GenBank（DNA序列數據庫）、PubMed（文獻檢索系統）、Nucleotide（核苷酸序列數據庫）、Genome（基因組數據庫）、Structure（結構數據庫或稱分子模型數據庫）、Taxonomy（生物學門類數據庫）、PopSet等在內的多個子庫，涵蓋了生物技術和生物醫學的多個方面，是科研人員的重要資源。
網址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov及網頁截圖如下：

    Gene序列：打開NCBI，選擇Gene,輸入所需要查找的基因，點擊search, 點擊對應的物種前的基因，找到NCBI Reference Sequence。可以看到Genomic，直接點擊Genomic下面的FASTA，可下載基因序列。

    mRNA和Protein序列：點擊NM開頭的轉錄本，跳轉進去就是mRNA，點擊Fasta，就可以下載mRNA序列；點擊NP就能得到mRNA對應的蛋白序列。

點擊FASTA，即為mRNA序列：

下翻可見其CDS序列，點擊CDS，CDS序列被標記，可復制CDS序列。

同理蛋白質序列可點擊該頁面的NP編號，點擊FASTA，即可得到蛋白序列。

啟動子序列：進入GeneBank，啟動子在mRNA的前1500-2000bp左右，因此在左側的區段設置往前1500bp，點擊Update View可得，序列前1500bp即為啟動子序列。

UTR序列：找到tool，序列查看，藍色為5’UTR和3’UTR, 紅色為CDS，綠色為內含子。

好了，今天的文獻解讀就到這里，可以推給有需要的朋友或者同學噢~