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2025-08-21 15:10:36
克隆形成
【應用簡介】
克隆形成及細胞克隆接種存活率，通過觀察單細胞集落形成情況，來計算克隆形成率，了解其增殖能力。
【技術原理】
單個細胞在體外持續增殖6代以上時細胞數量已達60個左右，此細胞群體成為克隆或集落，大小在1.0-2.0 mm之間。集落形成率表示細胞的獨立生存能力，各種理化因素可能導致細胞的克隆形成能力發生改變，通過計數克隆形成率，可對單個細胞的增殖潛力做定量分析，了解細胞的增殖率和對生存環境的適應性。軟瓊脂培養或平板克隆是最常用的方法。
【實驗方法】
Step1：細胞培養，調整細胞狀態
Step2：制備單細胞懸液
Step3：按不同的細胞濃度梯度把細胞均勻接種于培養平板
Step4：培養一段時間
Step5：觀察克隆情況，固定染色后計算克隆形成率
案例展示
不同腫瘤細胞的平板克隆
技術總結
1、對數生長期，細胞狀態良好的情況下，0.25%胰酶消化，離心后重懸時一定要吹打成單細胞懸液。可以選擇6孔板作為克隆培養板，按密度梯度（如100、200、300）接種進孔板中。接種后切記晃動平板，使細胞分布均勻。
2、培養2周左右（出現肉眼可見細胞集落時），即可固定染色。加固定液和染色液時，覆蓋住孔板底層即可。但如果長時間不處理，需增加液體量，防止液體干涸，影響拍照效果。
3、拍照時，務必使每個孔中無陰影，如無法達到，則逐個孔進行拍照。
送檢與交付標準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 凍存細胞 | 1.取對數生長期的細胞，消化離心收集細胞，加入凍存液吹打混勻，裝入凍存管，標明細胞名稱/細胞代數，凍存細胞數量在1-5*106個/ml。 2.項目啟動后細胞復蘇，復蘇后3天反饋細胞狀態，3-5天反饋細胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細胞詳細信息（名稱、培養基和其他培養條件等，如經過特別處理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標記，且標記清晰可識 |
| 復蘇后細胞 | 1.使用T25培養瓶運輸。細胞匯合度達到60%以上，裝滿培養液，只留紐扣大小的氣泡，瓶口用封口膜封好，標明細胞名稱/細胞代數/接種時間/培養基類型，瓶子固定運輸。 2.收到細胞后3天反饋細胞狀態，3-5天反饋細胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細胞詳細信息（名稱、培養基和其他培養條件等，如經過特別處理需告知并提供必要的信息） | 常溫 | 常溫 | |
| 質粒 | 1.純度高，無內毒素，無蛋白質，基因組DNA/RNA污染，質粒A260:A280的比值在1.8-2.0之間 2.濃度不低于0.5μg/μl，總量大于100μg，無內毒素處理 3. 載體詳細信息，包括名稱、大小、抗性、熒光標記 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，體積約200μl，標明制備時間，且沒有反復凍融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，體積約200μl，標明制備時間，且沒有反復凍融 3.明確是否表達熒光標簽蛋白及其種類，最好需要提供病毒載體圖譜； | -80℃ | 干冰 |
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